华东师范大学等团队开发非病毒定点整合CAR-T技术，基因编辑T细胞，靶向治疗非霍奇金淋...
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麻省理工科技评论-华东师范大学等团队开发非病毒定点整合CAR-T技术，基因编辑T细胞，靶向治疗非霍奇金淋巴瘤
基因编辑技术可以定向敲除、引入、修改基因组，被称作“基因魔剪”，广泛应用于生命科学领域，通过定向改造目的基因，达到治疗疾病的目的。
2020 年，来自美国加州大学伯克利分校化学系詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）教授和德国马普感染生物学研究所的埃马纽尔·夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）教授，因发明 CRISPR/Cas9 基因编辑工具而荣获诺贝尔化学奖。
癌症，曾被定义为不治之症。以前，患有恶性淋巴肿瘤的患者基本等同于被宣判“死刑”。如今，基因编辑技术被应用于T细胞的改造， 在 T 细胞 PD1 基因位点，精确地插入靶向 CD19 的 CAR 分子，制备成具有靶向治疗功能的 CAR-T 细胞。
这种被称作嵌合型抗原受体 T 细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）能有效地治疗非霍奇金淋巴瘤，为复发难治性非霍奇金淋巴瘤患者颁发“免死金牌”。
最近，华东师范大学生命科学学院张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力团队、浙江大学医学院黄河、胡永仙团队与上海邦耀生物科技有限公司合作开展研究，在 Nature 发布了题为《非病毒定点整合 CAR-T 细胞在非霍奇金 B 细胞淋巴瘤治疗中获得高安全性和有效性》（Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL）的论文。研究报道了非病毒定点整合 CAR-T 技术的突破及其治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验效果。
以非病毒、精确插入目的基因 为 CAR-T 细胞制备的切入点
病毒感染方式进行 CAR-T 细胞的制备使 CAR 序列以随机整合的方式插入到 T 细胞的基因组中。这种方式因具有不确定性，容易干扰正常基因的表达，具有潜在的致瘤风险，获得的 CAR-T 细胞均一性非常低。
非病毒定点整合 CAR-T 技术能够不使用病毒载体，一步制备实现 CAR 分子在特定位点的精确整合。该技术简化了 CAR-T 细胞的生产工艺，大大缩短了制备时间，减少了患者的等药时间，降低了患者的治疗费用。
本次研究以解决 CAR-T 治疗领域存在的痛点为出发点，采用非病毒的方式制备了定点整合型 CAR-T 细胞。
工作的前半部分主要对技术方法进行了优化，包括模板类型、模板设计、细胞状态等方面的摸索。之后，研究团队首先制备了 AAVS1 安全位点整合的 CAR-T 细胞进行概念验证。结果显示该 CAR-T 细胞能够在体内外有效地杀伤肿瘤细胞，证明了这一技术的可行性。
基于阻断 PD1 信号通路可以提高 T 细胞的抗肿瘤功能，研究团队又制备了 PD1 定点整合的 CAR-T 细胞，通过临床前实验、临床试验和单细胞测序等研究，证明了该 CAR-T 细胞在非霍奇金淋巴瘤治疗中具有出色的安全性和有效性。
实现从技术到临床的跨越
将非病毒定点整合 CAR-T 细胞从实验室带到临床的过程中，研究团队做了大量的工作。
临床试验的开展需要大规模工业级的 CAR-T 细胞制备工艺。因此，研究团队与邦耀生物开展了紧密的合作。
据张楫钦描述，CAR-T 细胞上会表达能特异性识别肿瘤抗原的单链抗体，在接触肿瘤靶细胞后，会分泌穿孔素、颗粒霉素对肿瘤细胞进行直接杀伤。同时也会分泌多种细胞因子，调动整个机体的免疫反应来清除肿瘤细胞。
CAR-T 细胞通过静脉注射的方式被输送到患者体内。CAR-T 细胞在清除肿瘤的过程中会分泌大量的细胞因子，引起较为剧烈的免疫反应，患者通常会出现发烧、炎症反应等临床表现，这也是 CAR-T 细胞发挥作用的表现。
临床试验证明，非病毒 PD1 定点整合 CAR-T 细胞可以持续性杀伤肿瘤细胞，即使在回输剂量较低的条件下依然取得了良好的疗效。在接受治疗的 8 例患者中，有 7 例达到了肿瘤完全消退的效果，其中有 5 例患者响应时间超过 1 年。
在肿瘤临床治疗过程中，治疗成本是患者最关心的问题之一。目前传统慢病毒制备的 CAR-T 产品定价高昂，FDA 获批的 CAR-T 产品定价在 40 万美金左右，国内获批的 CAR-T 产品定价在 120 万人民币左右。
造成这一情况的原因之一是病毒的大规模工业化制备有非常高的要求，需要经过较为复杂的制备流程和严格的质控，因此变相增加了 CAR-T 产品的成本。
基因编辑方法制备 CAR-T 细胞能将以上步骤化繁为简，物料成本有望大幅度降低。
CAR-T 产品定价高的另一个原因是目前的 CAR-T 疗法都是个性化治疗，采用定制化的方式进行制备。工厂需要为病人启用单独的生产线来制备 CAR-T 细胞，制备全部完成后才能将产能释放出来。
“目前获批的 CAR-T 产品总生产时间都要超过两周，对产线占用时间较长。CAR-T 细胞在体外培养的时间越长，物料和人工的成本都会随之增加”张楫钦说。
未来，如果只需制备少量功能强大的 CAR-T 细胞，则可以极大程度降低 CAR-T 产品的生产成本。另外，开发异体的通用型 CAR-T 产品也是一个重要的发展方向。
总之，物料、生产工艺、制备时间、临床方案、细胞有效性等方面的改进和优化都可以带来成本的降低。
克服困难，确保治疗的安全性与有效性
“早期的探索性阶段是本研究最难的部分，我们需要找到一个最优的技术方法并证明它可行。由于需要通过电转的方式在细胞膜上打孔导入基因编辑工具，而电击会对细胞造成较大的损伤，因此需要通过精细的参数调整和大量的条件优化来获得高阳性率、高存活率的 CAR-T 细胞。第二个难点是将来自实验室的小规模科研级技术方法转移到生产车间成为大规模工业级的生产工艺。由于两者的要求截然不同，这个过程也花费了我们大量的时间和精力。
第三个难点是临床试验，很高兴的是我们的合作团队在短时间内开展了高质量的临床试验，对本研究的顺利完成给予了巨大帮助”谈及研究中遇到的困难。”张楫钦说。
肿瘤的发病机理与一般疾病相比更复杂，与免疫系统相关。经临床验证，非病毒、PD1 整合的 CAR-T 细胞可以有效地消除肿瘤细胞，没有严重毒性。
定点整合 CAR-T 细胞可以实现 CAR 序列在 T 细胞特定位点的精确插入，因此显著提高了 CAR-T 产品的均一性，保证了 CAR-T 细胞临床治疗的安全性和有效性。
经临床验证，CAR-T 的使用剂量大幅降低。这些因素都能够增强 CAR-T 治疗方法的安全性。
在有效性方面，单细胞测序结果显示T细胞功能强大的患者在接受 CAR-T 治疗后更容易获益。另外，CAR-T 靶点的异质性也会直接影响 CAR-T 治疗的效果以及是否复发。
CAR-T 技术的发明起源于上世纪 90 年代。1989 年，科学家第一次提出了 CAR-T 的概念，通过导入人工改造的嵌合 T 细胞受体来提高 T 细胞的功能。但是由于第一代 CAR-T 疗法的临床效果并不理想，该领域的发展受到了限制。
进入 21 世纪，随着引入 T 细胞第二活化信号的第二代 CAR-T 疗法在临床治疗中取得了更好的疗效，CAR-T 技术得到了飞速的发展。2017 年，CAR-T 细胞产品首次获批上市，用于血液肿瘤的临床治疗。
未来，除了治疗肿瘤，CAR -T 技术或许还可以治疗自身免疫性疾病，清除衰老的细胞，或者治疗其他更多种类的适应症。结合基因编辑等新兴的生物学技术， CAR -T 技术的发展会迈向新的高度。
除了技术本身的发展和迭代外，还需要在应用转化、产业化制备等方面做出更多的努力。只有科研端与产业端的共同努力，才能制造出更多人人都能用得起的特效药。
参考资料：
1.Jiqin Zhang,Yongxian Hu,Jiaxuan Yang,Wei Li,Mingming Zhang,Qingcan Wang,Linjie Zhang,Guoqing Wei,Yue Tian,Kui Zhao,Ang Chen,Binghe Tan,Jiazhen Cui,Deqi Li,Yi Li,Yalei Qi,Dongrui Wang,Yuxuan Wu,Dali Li,Bing Du,Mingyao Liu&He Huang（2022）.Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL.Nature
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