蛋白质研究再迎新发现，湖北大学团队发现首个常温下偏爱性切割RNA的蛋白，有望开发可...
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麻省理工科技评论-蛋白质研究再迎新发现，湖北大学团队发现首个常温下偏爱性切割RNA的蛋白，有望开发可编程核酸酶工具
“本研究填补了对耐冷细菌来源的原核 Argonaute（pAgo）蛋白质的研究空白，拓宽了对 pAgos 生化性质和催化机理的认知，不仅为寻找能在中温条件下具有高效酶切活性的 pAgos 提供了新思路，也为靶向 RNA 的可编程核酸酶提供了新的选择。”湖北大学生命科学学院王飞博士表示。
审稿人也给予高度评价：“该工作是 Ago 蛋白质研究中一项重要的新发现，对这个特殊 Ago 蛋白质生物学功能的研究将激发许多有趣的问题，并可能将其发展为新的生物技术应用工具。”
近日，王飞所在的湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室马立新教授团队，报道了一种来自耐冷细菌沼泽粘液杆菌（Mucilaginibacter paludis）的 pAgo 蛋白质——MbpAgo，这也是当下首个在常温下偏爱切割 RNA 的 pAgo。
该团队表示，这项工作既拓展了人们对 Ago 蛋白质的认识，也为开发靶向 RNA 的可编程核酸酶工具提供了新选择。作为 RNA 操作的工具酶，MbpAgo 可被作为开发体内或体外靶向 RNA 的一种新手段。
据王飞介绍，课题组此前基于 PfAgo 开发了一系列检测 DNA 和 RNA 的检测方法。他们发现的 MbpAgo，可作为靶向 RNA 的可编程核酸酶，并具有开发基于 MbpAgo 特异性检测 RNA 技术的潜能。
目前，已有报道称利用 PfAgo 和 TtAgo，可以靶向切割野生型核酸分子，从而富集突变体，实现对突变体的高灵敏度检测。而该团队也可利用 MbpAgo 高效切割 RNA 的活性，进行 RNA 突变体的富集，还可对 RNA 末端进行加工，制备末端均一的 RNA 产物。
据介绍，能够靶向 RNA 的 Cas13，目前已被应用于体内的 RNA 病毒清除。因此，MbpAgo 也可以尝试进行体内 RNA 病毒的清除工作。此外，还可将 MbpAgo 和参与级联催化的各种酶进行融合，利用 RNA 支架效应，提高催化反应效率。
挖掘新型 pAgos 蛋白质，助力开发可编程核酸酶工具
此次研究要从 CRISPR-Cas 系统说起，该系统中的 Cas 效应蛋白质，可作为可编程核酸酶工具，并能对多种细胞和生物的基因组进行有效编辑。目前，CRISPR-Cas 系统已在基因工程和生物医学等多领域显示出巨大的应用潜力。
Cas 蛋白质需要在特定的向导 RNA介导下，靶向切割互补的靶 DNA 或靶 RNA。Cas 蛋白质使用的向导长度一般为100nt（Cas9）或 43nt（Cas12）左右，且其在切割 DNA 时需要识别特定的 PAM 基序（protospacer adjacent motif）。
作为另一类可编程核酸酶工具，pAgos 蛋白质利用长度为 15-25nt 的 DNA 或 RNA 作为向导，靶向切割 DNA 或 RNA。相比 Cas 蛋白质，pAgos 在原核生物中分布更加广泛且功能更具多样性。
截止目前，研究人员只对少数 pAgos 进行了结构或生化性质研究。pAgos 能否发展成为下一代基因编辑工具尚不清楚。因此，挖掘新型 pAgos 蛋白质，特别是在中温下具有高催化活性的 pAgos，对开发新的可编程核酸酶工具具有重要意义。
迄今为止发现的首个偏爱切割 RNA 的 pAgo
在该工作中，王飞和同事对来源于耐冷细菌沼泽粘液杆菌（Mucilaginibacter paludis）的 MbpAgo 进行了系统的生化性质研究。他们发现 MbpAgo 偏爱切割RNA，该性质与已研究的 pAgos 大相径庭，但与 eAgos 类似。目前报道的大部分 pAgos 偏爱 DNA 靶，真核 Ago 蛋白质（eAgos）偏爱 RNA 靶。
此外，该团队还发现尽管耐冷细菌沼泽粘液杆菌的生长温度是 2-33°C，最适生长温度是 20°C，但 MbpAgo 能在 37°C 具有高效的切割活性。
近日，相关论文以《一种来源于耐冷细菌 Mucilaginibacter paludis 的具有 RNA 靶标偏好的可编程 pAgo 核酸酶》（A programmable pAgo nuclease with RNA target preference from the psychrotolerant bacterium Mucilaginibacter paludis）为题，发表在 Nucleic Acids Research（IF：16.972）上[1]。博士研究生李文强和刘洋为第一作者，湖北大学生命科学学院马立新教授和王飞博士为通讯作者。
审稿人认为这项工作延续了该课题组在 pAgos 领域的研究，提供的数据质量很高，同时 MbpAgo 也是迄今发现的、首个以 DNA 为向导偏爱切割 RNA 的 pAgo。
这种对 RNA 靶具有强烈偏爱性的 pAgo 是罕见的，因为到目前为止发现的 pAgo 都是偏爱 DNA 靶，只有少数 pAgo 同时具有靶向 DNA 和 RNA 的活性。
偏爱切割 RNA？此“偏爱”非彼“偏爱”
据悉，早期研究的具有催化活性的 pAgos 都来自嗜热生物，并且均是偏爱靶向切割 DNA。尽管这些 pAgos 与 Cas 蛋白质类似，能在核酸引导下靶向切割 DNA，但都需要在高温条件下才具有较好的切割活性，因此不适合在中温生物中进行基因编辑。
王飞说道：“2016 年，河北科技大学生物科学与工程学院韩春雨教授团队报道称，NgAgo 在 37°C 能以 DNA 为向导有效切割 dsDNA，并且实现了 NgAgo 在人类细胞的基因组编辑，这项工作在科研界引起了很大的轰动。因此，NgAgo一度被认为是继 CRISPR-Cas 系统之后的下一代基因编辑工具。
然而，这项工作因为许多实验室无法重复其所描述的结果而选择撤稿。随后多项研究表明 NgAgo 具有靶向切割 RNA 的活性，没有明确的证据表明 NgAgo 具有靶向切割单链 DNA 的活性。
尽管 NgAgo 尚未实现在哺乳细胞中的有效基因编辑。但此类研究也给了我们启示，即在中温物种挖掘能在生理温度下有效切割 dsDNA 的 pAgos，将有望实现 pAgos 在哺乳细胞中的基因编辑。”
2016 年起，该团队开始启动从中温物种挖掘能有效切割 dsDNA 的 pAgo 的研究。2019 年两支国外团队报道了中温微生物来源的 CbAgo 能在 37°C 有效切割 dsDNA。
与此同时，该团队也从合成的 100 余条中温生物来源的 pAgos 基因中，通过异源重组表达和生化研究，发现能够在 37°C 有效切割 dsDNA 和 RNA 的 KmAgo[2]。接着，国内外多个团队报道了多个能在中温有效切割 dsDNA 的不同来源的 pAgos。
王飞和同事发现，这些中温微生物来源的 pAgo 不仅在中温下具有酶切活性，在中高温 50°C 也同样具有活性。因此，他们推测是否可以从耐冷细菌中进行 pAgo 的挖掘，寻找在中温具有高的切割活性的 pAgo？随后，课题组从耐冷细菌沼泽粘液杆菌中挖掘到 MbpAgo，并发现它具有偏爱切割 RNA 的独特性质。
一度长期无进展，多名同学曾想放弃
尽管已有数篇代表性论文，但该团队在 Ago 的研究上并不顺利。2016 年开始，课题组每年都投入大量的科研经费和人力资源（实验室所有的博士和部分优秀的硕士研究生）来进行 Ago 相关研究。
当时，整个学界发表的 pAgos 论文只有寥寥几篇，可供参考的资料的也很少。很多实验都只能自己探索，这一度让进展非常缓慢，很多同学都想放弃。马立新教授发现后，及时把大家组织到一起，讲解这项工作的意义和重要性，带领团队仔细阅读已发表的所有 pAgos 相关文献，研究每一个实验细节。
展攻关研究。王飞说：“那段时间，马老师每天都会抽时间组织我们交流每个小组的实验进展，大家彼此取长补短，慢慢地都开始有新发现，很多研究也取得了可喜进展，大家也对 Ago 充满了信心，坚信我们能够在这个领域取得突破！”
“马老师身兼生科院的院长和省部共建生物催化与酶工程重点实验室的主任一职，平时行政事务也很多，很多时候我们都是在中午休息时间一边吃盒饭一边讨论实验。马老师对科研的执著与坚韧深深的感染了我们每一个人，老师都这么努力了我们有什么理由不去拼一拼呢！”王飞补充称。
此外，疫情期间刘洋博士因故滞留在外地无法返校开展实验，李文强博士主动提出他在实验室进行实验操作，由刘洋博士居家撰写论文初稿，两人分工合作尽快把科研成果整理出来发表，希望能为抗击新冠病毒提供一个新的工具。目前，这两位博士均已完成学业，并留在该团队做博士后，以继续开展 Ago 相关研究。
那么，课题组的下一个“小目标”是什么？王飞说，课题组将在其原生宿主耐冷细菌沼泽粘液杆菌中，研究 MbpAgo 在体内是否参与防御外源RNA的入侵，并探究其发挥防御功能的机制。对其体内功能的研究，将有利于推进 MbpAgo 在异源系统中进行靶向 RNA 编辑的应用。
同时，他们还将研究 MbpAgo 能否在哺乳动物细胞内靶向 RNA，以期实现 RNA 干扰。如能实现 RNA 干扰，那下一步该团队将尝试将 RNA 单碱基编辑器、与 MbpAgo 进行融合，从而对 RNA 进行编辑。
-End-
1、Li, W., Liu, Y., He, R., Wang, L., Wang, Y., Zeng, W., Zhang, Z., Wang, F., & Ma, L. (2022). A programmable pAgo nuclease with RNA target preference from the psychrotolerant bacterium Mucilaginibacter paludis. Nucleic acids research, 50(9), 5226–5238. https://doi.org/10.1093/nar/gkac315
2、Liu, Y., Li, W., Jiang, X., Wang, Y., Zhang, Z., Liu, Q., He, R., Chen, Q., Yang, J., Wang, L., Wang, F., & Ma, L. (2021). A programmable omnipotent Argonaute nuclease from mesophilic bacteria Kurthia massiliensis. Nucleic acids research, 49(3), 1597–1608. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1278
3、Wang, F., Yang, J., He, R., Yu, X., Chen, S., Liu, Y., Wang, L., Li, A., Liu, L., Zhai, C., & Ma, L. (2021). PfAgo-based detection of SARS-CoV-2. Biosensors & bioelectronics, 177, 112932. https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112932
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