浙工大团队重编程非血红素铁酶，衍生出多种叠氮产品，总周转率高达10600次
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麻省理工科技评论-浙工大团队重编程非血红素铁酶，衍生出多种叠氮产品，总周转率高达10600次
对于天然蛋白质来说，非生物化学转化方法具有重要的积极意义。该方法可以使蛋白酶重编程实现兼具区域和对映选择性，以及遗传可调性的合成反应，从而拓展酶催化反应的更多应用领域。例如，非血红素铁酶、黄素酶和碳酸酐酶等都可以通过重新编程来介导多种有用的有机化学反应。
不过，由于目前大部分有机合成反应未发现生物学对应物，且这些反应的转化机理不是自然演化出来的，目前酶还未释放出在现代化学合成领域的全部实力。因此，若能把合成化学中的基本化合反应与生物学中的酶催化机制结合起来，或能带来不少关键的实用价值。
近日，浙江工业大学化学工程学院教授杨云芳联合美国约翰霍普金斯大学化学系助理教授 HuangXiongyi 团队、卡内基梅隆大学助理教授 Yisong Guo 团队等采用自由基中继反应对非血红素铁酶进行重编程，以酰胺自由基为氢原子吸收剂、铁（III）-N3 中间体为自由基捕获剂催化了非生物 C（sp3）-H 叠氮化反应，并运用点击化学的概念开发了一个能够迅速进化以评估酶催化性能的高通量筛选（High throughput screening，简称 HTS）平台，还带来了许多“总周转率高达 10600 次、对映体过剩率超过 93%”的叠氮产品。
2022 年 5 月 19 日，相关论文以《非血红素铁酶进入非生物自由基中继 C（sp3）的定向进化−叠氮化》（Directed evolution of nonheme iron enzymes to access abiological radical-relay C（sp ^3）−H azidation）为题发表在 Science 上。
据了解，这项研究的设计原则是，“天然金属酶与合成金属催化反应共享机理元素，前者会在有机合成反应中表现出混杂活性，从而进化出新的催化功能。”
因此，该团队首先提出设想：非血红素铁酶能够被重新编程，再使用活化铁（II）中心的初始底物来转导自由基传递，以产生反应性酰胺基自由基，再转移铁（III）结合碳中心自由基的配体执行自由基中继 C-H 官能化。这样一来，可以采用氧化还原中性途径，以生物催化反应带来一种非血红素铁酶完成天然铁（II）/铁（IV）催化循环的全新途径，并能够将其用在 C-H 功能化的研究中。
其次，研究人员运用基于铜催化叠氮化物-炔烃环（Copper-Catalyzed Alkyene-Azide Cycloaddition Reaction，CuAAC）加成的 HTS 平台，对超过 5000 个易错聚合酶链式反应和基因位点饱和诱变而来的克隆变体进行分析，确定了 Sav HppDAz1 和 Sav HppDAz2 两种对映选择性变体，并以定向进化来提高对映选择性变体的性能。
接下来，该团队在优化生物催化反应的反应条件及对比各类 N-氟酰胺底物后得出。
基于此，研究人员进一步制备了初级有机叠氮化物 11N，并让其参与 CuAAC 反应以合成出雌酮衍生物，这证实他们所开发平台能够通过和生物相容性反应串联使用来生成功能高分子。
为验证铁（III）-N3 物质也参与该反应，该团队培养了 Sav HppD Az1•Fe（II）•N 3 与缺少反应性苄基 C-H 键的 N-氟酰胺 18NF。在通过光学吸收观察到红色物质的缓慢积累后，他们得出了肯定的答案。
此外，研究人员通过计算建模明确了该反应的分子基础。结果表明，“初始 N-F 激活步骤是速率限制的，随后是快速 1,5-HAT（氢原子转移）到 N 中心自由基。”这背后的机理与铁催化的氟酰胺定向氟化相似。
总的来说，该团队此次以金属催化自由基中继来完成进行 C（sp3 ）-H 的功能化反应，这极大地扩展了非血红素铁酶的催化范围。值得一提的是，该研究使用定向进化促进非血红素铁氧化酶来实现对映选择性叠氮转移，其生成的叠氮化合物位于邻位烷基上，这或是合成生物正交偶联化合物的重要开端。
对此，该团队表示，“合成化学中的各种自由基生成过程以及金属酶自由基捕获能力，将为推进自由基生物催化提供强大而通用的策略。”
-End-
专业支持：秦九方
参考：
1、JINYAN RU et al. Directed evolution of nonheme iron enzymes to access abiological radical-relay C(sp3)−H azidation. Science（2022）https://doi.org/10.1126/science.abj2830
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